Определение гадолиния в присутствии альбумина

[AnnaSherry]

Здравствуйте!
В лаборатории я работаю над определением гадолиния (= Гд) в растворе. Для определения Гд мы используем реагент Арсеназо 3, который образует с Гд окрашенный комплекс (спектрофотометрическое определение). Реакция протекает в кислой среде (рН=2)
Недавно у меня появились образцы, где помимо Гд присутствует альбумин (ЧСА). Альбумин ассоциируется с красителем и искажает результат. в связи с этим встал вопрос, как избавиться от альбумина?
Мы пробовали сжигать образцы в муфельной печи (т=550 градусов), однако там, очевидно, образовывались нерастворимые в воде оксиды. тогда мы стали разлагать сильно концентрированной кислотой (6 м HCl). По идеи там происходит разложение альбумина до аминокислот. Однако, у нас все равно искажается результат.
пытаясь найти что-нибудь в интернете я натолкнулась на информацию, что медики используют Арсеназо 3 для определения кальция в сыворотке, правда в щелочной среде. Также я нашла информацию о применении хлорфосфотазы для определения Гд в кислой среде в сыворотке крови.

в связи с этим мне очень хочется узнать:

Как вы устраняете мешающее влияние альбумина и других составляющих крови (ну например, железа)

[denson]

Скажу сразу. В лабораторной медицине принято использовать стандартизированные и промышленно изготовленные тест-наборы. И проблемы, как устранить те или иные интерферирующие агенты за нас решают производители этих наборов.
Вот инструкция на определение кальция с помощью арсеназо, где не совсем полностью, но расписано что в наборе есть. Это стандартизованный полностью готовый к использованию тест набор с заявленными характеристиками. Что называется готовое решение "из коробки".
[Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ]
Давайте начнем с этой инструкции, а потом задавайте вопросы, и по мере возможности мы на них ответим

[Assandra]

Можно попробовать осадить альбумин трихлоруксусной кислотой.

[AnnaSherry]

Сообщение от Assandra

Можно попробовать осадить альбумин трихлоруксусной кислотой.

Я пробовала растворять в 1н HNO3, а затем центрифугировать (13,2 тыс об/мин, 30 минут), но альбумин все равно попадает в супернатант.
А методику с трихлорусусной кислотой нашла в интренете, но там было нечетко написано, что и как, и в каких пропорциях.


а вы не могли бы дать ссылочку на методику с ТХУ к-той?

[denson]

Assandra получает 5 за сообразительность. Модератор раздела (то есть я) получает тумака за забывчивость
Но я таки откопал одну инструкцию по депротеинизации ТХУ ксилотой. Переписываю буквально:
-кислота трихлоруксусная, 1,22 моль/л (почему именно 1,22 не спрашивайте) 0,5 мл
-вода дистиллированная 1 мл
-сыворотка 0,5 мл
Перемешать и центрифугировать при комнатной температуре в течение 10 мин при 3000 об/мин

[AnnaSherry]

С ТХУ попробую завтра.
А вот вопрос.
Что происходит с альбумином (как и вообще с белком) при воздействии ТХУ к-ты, он разваливается до первичной цепочки или аминокислот? Разрушаются ли дисульфидные мостики?

[AlexPAR]

Впервые слышу про Gd, да и Арсеназо III пользовался, как говорил denson, просто поставив реактив с ним в анализатор.
В Википедиии написано, что Арсеназо III образует комплексы со многими металлами, про белки там ничего не сказано. Реактив в наборе для определения кальция в сыворотке крови содержит буфер, Арсеназо III и детергент. Может производитель добавляет еще что-нибудь, но вряд ли это для устранения альбумина. Правда разведение сыворотки реактивом в 100 раз.
В Ваших пробах присутствует именно ЧСА или есть и другие компоненты сыворотки крови? Какое у Вас разведение пробы? Вы уверены, что искажение результатов именно из-за альбумина, а не за счет других металлов?

[AlexPAR]

Еще вопросы. Искажение в какую сторону? Понижение или повышение от ожидаемого? Сначала думал что завышение, но "пробовали сжигать образцы в муфельной печи (т=550 градусов), однако там, очевидно, образовывались нерастворимые в воде оксиды" говорит скорее о занижении результатов. В [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] тоже сжигали, температура там повыше. Правда это 1996г

[AnnaSherry]

Вообще у нас лекарственное вещество с гадолинием и альбумином (разработка препарата для МРТ). Отсюда гадолиний. Альбумин для синтеза используем аптечный (Baxter) и лиофилизат от Sigma. Других металлов там не должно быть (в том числе железа). Завышение идет именно по альбумину. Кстати, даже после термической обработки, Арсеназо все равно реагирует с аминокислотами (проводила качественный опыт добавляла к арсеназо аминокислоты (аргинин)и раствор посинел, что значит, что он реагирует).

Насчет занижения и завышение результатов. Когда мы сжигали пробу в муфельной печи, результат был именно заниженным (почему до сих пор не поймем), но после кислотного раложения при 105 градусах, результат был именно завышен, что говорит о наличии примеси, которая садится на те же реакционные центры, что и гадолиний.

[AlexPAR]

Возможно, я зациклился на других металлах, но мне трудно представить, что аминокислота или альбумин дают такую же окраску, как тот же кальций, для которого и делаются наборы с арсеназо 3. Но: "Когда мы сжигали пробу в муфельной печи, результат был именно заниженным" - говорит не в пользу моей версии о др. металлах.
То, что компоненты сыворотки влияют на результат измерений, известно. Калибровку б/х методов рекомендуется проводить калибраторами на основе сыворотки, а не их водными растворами. В публикации [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] искажения 10, ну 20%.
А Вас какие искажения? Содержание альбумина в Вашей пробе, наверное, как в крови, а гадолиния около 0,5мМ (кальция в сыворотке раза в 4 больше)? Если так, то искажение альбумином будет сильнее (не представляю, как он взаимодействует с арсеназо 3)
Думаю, что сжигание проб более правильно, хотя и трудоемко. Хорошо бы посмотреть пробы на атомно-абсорбционной спектроскопии, если есть такая возможность.
С ТХУ у Вас что-нибудь получилось?

[AnnaSherry]

С ТХУ результат получился неплохой.
Я правда делала чуть-чуть иначе.
Я брала 0,75 мл 20% ТХУ к-ты и 0,75 мл разведенной пробы, в которой содержался альбумин и гадолиний известной концентрации. Альбумин было порядка 0,5 мг/мл (я разводила сильно пробы). Дальше мы мы центрифугировали Но проблема в том, что чем больше разводишь пробу (чтобы уменьшить концентрацию альбумина), тем меньше там становится гадолиния. И его становится труднее определить.
Мы попробовали меньше разводить пробы. Но при концентрации альбумина в 1,0 мг/мл ошибка определения гадолиния составляла порядка 20%. Это многовато.

Атомная абсорбция была бы идеальным выходом.У нас была возможность это делать. но к сожалению человек, который анализировал наши пробы, делал это "на отвяжись" и пока что нам негде делать атомную аобсорбцию. Хогтя она, Вы правы была хорошим выходом. Такое пламя сжигает атомизирует все в один момент.

[AlexPAR]

Идей больше нет.
Могу добавить, что осадить белки можно осадить фосфорно-вольфрамовой или фосфорно-молибденовой кислотами. Они осаждают и белки, и пептиды. ТХУ - только белки. Правда, они не так распространены в лабораториях, как ТХУ.

[AlexPAR]

Вопросы.
Зачем разводить пробу, если белки осаждаете? Если с уменьшением разведения растет ошибка, то почему Вы считаете что результат с ТХУ получился неплохой? Можно предположить, что влияние ЧСА устранено не полностью, раз разведение влияет на результат.
Ошибка 20% - это ошибка воспроизводимости или ошибка от ожидаемого результата?
Если бы Вы имели возможность свободно использовать атомную абсорбцию, Вы бы не возились с арсеназо. Тут хотелось бы посмотреть, что есть в пробах кроме Gd плюс его точная концентрация. За Вас можно порадоваться - Вы имеете возможность (хоть и очень маленькую) использовать этот метод.